Práctica 18: Detección de cuerpos de Heinz. (PXXI)(B1)

Fecha: 28-11-14

Detección de cuerpos de Heinz.(PXXI).

Introducción:

Los cuerpos de Heinz son precipitados de hemoglobina, son una serie de granulaciones que se sitúan en la periféria de los hematíes y que se tiñen de color púrpura con cristal violeta, se producen enfermedades congénitas que comportan una inestabilidad de la hemoglobina que hace que esta se desnaturalice y precipite en presencia de algunos medicamentos.

Material:

-Tubo de ensayo.

-Dos pipetas gaduadas.

-Una pipeta pasteur.

-Un baño de agua.

-Dos portaobjetos.

-Un microscopio.

Reactivos:

-Colorante cristal violeta.

-Líquido de inmersión.

Muestra:

-Sangre.

Fundamento:

En esta práctica podremos observar los cuerpos de Heinz gracias a que los precipitados intraeritrocitarios de Hb desnaturalizada se tiñen con el cristal violeta y, adquieren el aspecto de pequeñas granulaciones que son los cuerpos de Heinz.

Procedimiento:

1. Al tener ya cristal violeta preparado pero al realizar la primera práctica hemos observado que no servia ya que se veían grumos y precipitados, hemos realizado una nueva solución colorante de cristal violeta:

-Mezclar 10g de cristal violeta en 40ml de suero fisiológico y 20ml de agua destilada.

-Agitar la mezcla durante 5 minutos.

-Añadir 41ml de suero fisiológico y 9ml de agua destilada.

2. Mezclar en un tubo de ensayo volúmenes iguales de solución colorante cristal violeta y la sangre problema.

3. Reposar la mezcla en el baño de agua durante 5 minutos a 37ºC.

4. Realizar un frotis una vez pasado el tiempo, con la mezcla y dejar secar.

5. Con el objetivo de inmersión, observar el frotis a microscopio.

Interpretación de los resultados:

Los cuerpos de Heinz una vez teñidos se observan como pequeñas granulaciones en la periféria de los hematíes. Solo son observables en patologías de la Hb.

Práctica 17: Contaje de reticululocitos. (PXVI)(B1)

Fecha: 27-11-14

Contaje de reticulocitos. (PXVI).

Introducción:

Los reticulocitos son los eritrocitos sin madurar y como su nombre indica, contienen un reticulo o red de cromatina formada por restos de ARN, mitocrondrias y otros orgánulos celulares.

Tienen un tamaño de 8 a 9 micrometros de diametro. Permanecen en la médula ósea unos 2 o 4 días y despúes salen a la sangre periférica, donde terminan el proceso de maduración en unas 24 horas.

Su cantidad en sangre periférica es un reflejo de la actividad eritropoyética medular.

Material:

-Microscopio.

-Tubos de hemolisis.

-Pipetas pasteur.

-Portaobjetos.

-Baño de agua.

-Sistema de filtración.

Reactivos:

-Azul de cresil brillante en polvo.

-Solución salina al 0,9%.

-Citrato sódico al 3%.

-Agua destilada.

-Aceite de inmersión.

Muestra:

Sangre anticoagulada con EDTA.

Fundamento:

-Mediante esta tinción, podemos observar los reticulocitos a microscopio, este colorante puede dar lugar a precipitados de los restos de ARN y se observarán como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.

-Según el grado de maduración, presentará un modelo de reticulocito diferente.

Procedimiento:

1. Preparación del colorante:

-Mezclar 80ml de solución salina y 20ml de citrato sódico al 3%(Si en 100ml hay 3g de citrato sódico, en 20ml hay X, X=0.6g de citrato sódico).

-Pesamos 1g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior.

-Se filtra antes de usarse.

2. Echamos tres gotas de solución colorante en un tubo de hemólisis y otras tres gotas de sangre, mezclamos suavemente y cerramos con papel parafilm.

3. Introducimos en el baño de agia a 37ºC durante cinco minutos.

4. Pasado ese tiempo sacamos el tubo y con la ayuda de una pipeta pasteur, realizamos un frotis en un portaobjetos y dejamos secar.

5. Colocar una gota de aceite de inmersión y enfocar con el objetivo de 100x.

Interpretación de los resultados:

Los hematies estan teñidos de color verde amarillento y los reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior hilos finos de color azul.

Práctica 16: Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo.(PXIV)(B1)

Fecha: 21-11-14

Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo.(PXIV).

Introducción:

Cuando se centrifuga la sangre, la fracción forme, que contiene los hematíes, se agrupa en el fondo del tubo y el plasma queda en forma de sobrenadante. El valor de hematocrito es la relación existente entre el volumen ocupado por los hematíes y el ocupado por la sangre total, expresada en forma de porcentaje.

Material:

-Un capilar.

-Plastilina.

-Algodón o gasas.

-Una centrífuga de hematocrito.

-Una regla milimetrada o un lector de hematocrito.

Muestra:

-Sangre capilar o venosa anticoagulada.

Fundamento:

-En esta práctica vamos a obtener el valor de hematocrito de una persona, y al ser sangre capilar puede que salga más alto que el de una bolsa de sangre.

Procedimiento:

1. Llenar un capilar (3/4) de sangre capilar o venosa.

2. Sellar el extremo con plastilina.

3. Colocar el capilar en la centrífuga enfrentado a otro capilar con el mismo nivel de contenido durante unos cinco minutos.

4. Con la ayuda de un microhematocrito medimos el nivel de hamtocrito o bien con una regla milimetrada.

-El microhematocrito nos dice directamente lo que mide.

-Al utilizar la regla hay que emplear una fórmula o regla de tres: 

HCT=L2·100/L1

Interpretación de los resultados:

El valor normal del HCT esta comprendido entre el 42 y el47% en las mujeres y entre 45 y 52% en los varones.

En este caso nuestra muestra nos ha dado una valo de 45%.

Un valor bajo de HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia y un valor alto, suele ser signo de padecimiento de una poliglobulina.

Práctica 15: Recuento de hematíes. (PXII)(B2)

Fecha: 21-11-14

Recuento de hematíes. (PXII).

Introducción:

-El recuento de hematíes consiste en la determinación del número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre.

Material:

-Una pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos.

-Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.

-Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer.

-Un cubre.

-Un microscopio.

Muestra: 

-Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada.

Reactivos:

-Líquido de dilución, debe ser isotónico con el plasma, para evitar la alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes., el más utilizado es el de  Hayem, que se compone de las siguientes sustancias:

     -2,5g de sulfato sódico.

     -0,5g de cloruro sódico.

     -0,25g de cloruro mercúrico.

     -100ml de agua destilada.

Si contiene precipitados, antes de usarlo deberá ser filtrado.

Fundamento:

-Para el recuento en cámara de glóbulos rojos, se diluye la sangre en un líquido apropiado y posteriormente se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentas las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos.

Procedimiento:

1. Sellar un cubre  sobre el retículo de la cámara humedeciendo las bandas laterales de la cámara de recuento.

2. Con la pipeta diluidora, absorber sangre hasta 1.

3. Limpiar con cuidado la punta de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de la sangre.

4. Seguidamente aspirar líquido diluyente hasta la señal 101.

5. Quitar el tubo de goma y homogenizar el contenido moviendo la pipeta con cuidado durante dos o tres minutos.

6. Desechar las tres primeras gotas y depositar la cuarta  entre la cámara y el cubre.

7. Dejar reposar la sangre unos minutos para que las células presentes puedan sedimentarse.

8. Enfocar el retículo con el objetivo de 40xy verificar que la distribución de los ematíes es homogénea.

9. Contar los hematíes presentes en 80 cuadros pequeños del cuadro grande central(5 cuadrados medianos del cuadro grande central), solo se cuentan los hematíes contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con las líneas de demarcación superior o derecha y se sigue un orden en zig-zag.

Interpretación de los resultados:

-Sabiendo que el cuadrado grande central tiene 5 cuadrados medianos, la longitud  de cada lado del cuadrado grande central es de 1mm, la longitud des espacio entre ducho cuadro y el cubre es de 0,1 mm y que la dilución dela sangre previa al recuento es de 100:

RBC=H·5·10·D

RBC= Recuento de hematíes por mm cúbico de sangre.

H= Hematíes contados en cinco cuadrados medianos.

D= Factor de dilución.

RBC= 573·5·10·100=2865000

Práctica 14: Visualización de una cámara de recuento (PXII)(B1)

Fecha: 20-11-14

Visualización de una cámara de recuento. (PXII).

Introducción:

En esta práctica vamos a familiarizarnos con las cámaras de recuento de glóbulos blancos y de glóbulos rojos.

Material:

-Una cámara de recuento.

-Un microscópico.

Procedimiento:

1. Observar con el microscopio el retículo de la cámara de recuento:
-Primero con el objetivo de 4x.
-Luego, con el objetivo de 10x.
-Después, con el objetivo de 40x.

2. Enfocar con el objetivo de 10x, uno de los cuadrados grandes situados en las cuatro esquinas del retículo.

3. Contar el nº de cuadros medianos contenidos en ese cuadro grande periférico: 16 cuadros medianos.

4. Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm, calcular:
- La longitud de los lados de cada cuadro grande periférico: 1mm.
-La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico: 0.25mm.

5. Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0,1mm , calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de:
-El retículo entero: V=l·l·h; V=3·3·0,1=0,9mm cúbicos.
-Un cuadrado grande periférico: V=1·1·0,1=0,1 mm cúbicos.
-Un cuadrado incluido en un cuadrado grande periférico: V= 0,25·0,25·0,1= 0,0625mm cúbicos.

6. Enfocar con el objetivo de 10x, el cuadrado grande central.
-Contar el nº de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande central: 16 cuadrados medianos.
-Contar el nº de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos: 16 cuadrados pequeños.

7. Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm, calcula:
-La longitud de los lados del cuadrado grande central: 1·1 mm
-La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadro grande central: 0,25·0,25 mm
-La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños contenidos en uno de esos cuadrados medianos: 0.0625·0.0625mm

8. Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0.1mm, calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de:
-El cuadrado grande central: V=1·1·0,1=0,1mm cúbicos.
-El cuadrado mediano englobado en el cuadrado grande central: V=0.25·0,25·0,1= 0,0625mm cúbicos.
-Un cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadros medianos: V= 0.0625·0,0625·0,1=0.000390625 mm cúbicos.

Práctica 11:Tinción panóptico rápido. (PXI)(B1)

Fecha: 13-11-14

Tinción panóptico rápido (PXI).

Introducción:

Este método de tinción diferencial es un sistema que aún la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos como Giemsa y Wright, con una rapidez de ejecución.

Material:

-Tres cubetas de Wertheim.

-Dos portaobjetos.

-Pipeta Pasteur.

-Frasco lavador.

Muestra:

-Sangre capilar o venosa anticoagulada.

Reactivos:

-Solución nº1: Solución alcohólica de tririlmetano.

-Solución nº2: Solución tamponada de xanteno.

-Solución nº3: Solución tamponada de tiazina.

Fundamento:

-Esta práctica presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión, donde la extensión se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado y así obtenemos el mismo resultado que una tinción de Wright o de Giemsa.

Procedimiento:

1. Realizar una extensión sanguínea y dejarla secar.

2. Una vez seca, como ya tenemos preparadas las cubetas con las soluciones, el procedimiento a seguir es: 

-Sumergir la extensión en la cubeta con la solución nº1 cinco veces, cada vez un segundo sumergida.

-Sumergir la extensión en la cubeta con la solución nº2 otras cinco veces, cada vez un segundo.

-Sumergir la extensión en la cubeta con la solución nº3 cinco veces, cada vez un segundo sumergida.

3. Dejar escucrrir y lavar con agua destilada y dejar secar.

Interpretación de los resultados:

-Al igual que las tinciones de Giemsa y de Wright, se deberián observar las diferentes fracciones de la sangre, pero en clase, al utilizar sangre de la bolsa, no se han observado leucocitos.

Práctica 10: Tinción de Wright. (PX)(B1)

Fecha: 13-11-14

Tinción de Wright. (PX).

Introducción:

-El colorante de Wright es una solución de esoina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azul B (del 10 al 25%)junto con otros derivados delalcohol metílico. En esta práctica las celulas deberían de verse igual de coloreadas que con la tinción de Giemsa.

Material:

-Microscopio.

-Cristalizador y soporte de portas.

-Pipetas Pasteur.

-Frasco lavador.

-Tubos de ensayo.

Muestra:

-Sangre capilar o venosa anticoagulada.

Reactivos:

-Solución de eosina-azul de metileno según Wright.

-Solución pH 7,2.

-Aceite de inmersión.

Fundamento:

-En esta práctica intentaremos lograr una visión clara de los distintos componentes de la sangre, asi como eritrocitos, linfocitos, plaquetas... gracias a la tinción de Wright.

Procedimiento:

1. Realizar una extensión sanguínea y dejarla secar.

2. Colocamos la extensión en el soporte de portas sobre el cristalizador y cubrir la muestra con 1ml de eosina-azul de metileno, dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón pH 7,2, eliminamos el exceso y dejamos secar verticalmente.

3. En un tubo de ensayo diluimos 0,5ml de eosina-azul de metileno con 0,5ml de solución tampón pH7,2.

4. Cubrimos la muestra con esta mezcla y dejamos actuar entre tres y cinco minutos.

5. Lavar la muestra con agua destilada y otra vez con solución tampón pH 7,2, eliminamos el exceso y dejamos secar verticalmente.

6. Colocamos un cubre en la extensión para poder echarle una gota de aceite de inmersión y mirar a microscopio con 100x como objetivo.

Interpretación de los resultados:

Al igual que en la tinción de Giemsa, se deben observar las distintas fracciones de la sangre, tales como glóbulos rojos, plaquetas y glóbulos blancos, pero al estar utilizando sangre de la bolsa, no se pueden observar leucocitos.

Práctica 9:Tinción de giemsa. (PIX)(B1)

Fecha: 13-11-14

Tinción de Giemsa.(PIX)

Introducción:

Con esta tinción obtenemos una tinción diferencial, capaz de discriminar entre las distintas estruccturas celulares según se tiñan estas con el colorante ácido, con el básico o con la mezcla de los dos.

Material:

-Dos portaobjetos.

-Cristalizador y soporte.

-Pipetas pasteur.

-Frascos lavadores.

-Tubos de ensayo.

Muestra:

- Sangre capilar o venosa anticoagulada.

Reactivos:

-Colorante en solución según Giemsa de Panreac.

-Solución tampón pH 7,2 de Panreac.

-Metanol.

-Aceite de inmersión.

Fundamento:

-En esta práctica intentaremos lograr una visión clara de los distintos componentes de la sangre, asi como eritrocitos, linfocitos, plaquetas... gracias a la tinción de Giemsa.

Procedimiento:

1. Preparar una extensión sanguínea.

2. Dejamos reposar el porta con la extensión en el soporte sobre el cristalizador y cubrir la muestra de metanol, durante tres minutos.

3. Eliminamos el exceso de metanol y dejamos secar.

4. Mezclamos en un tubo de ensayo 0.2 ml de azul de metileno según Giemsa y 2 ml de solución tampón pH 7.2.

5. Con la ayuda de una pipeta pasteur cubrir la muestra de esta solución, dejando actuar durante 25 minutos.

6. Eliminamos el exceso y lavamos con agua destilada y posteriormente con tampón pH 7.2, dejamos secar en posición vertical.

7. Una vez seca la tinción echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio con el objetivo de 100x y observar a microscopio.

Interpretación de los resultados:

Los eritrocitos se tiñen de color rosa y las plaquetas de color violeta. 

Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo.

 Los eosinófilos se observan con el núcleo azul violeta, el citoplasma azul y los gránulos de color rojo anaranjado.

 Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul oscuro.

 Los monocitos y linfocitos se observan con un núcleo de color violeta y el citoplasma azul, un poco más claro que el monocito.

Práctica 8: Preparación de gota gruesa (PVIII)(B1)

Fecha: 10-11-14

Preparación de gota gruesa.(PVII).

Introducción

Los parásitos palúdicos, en algunas etapas de su ciclo vital, se encuentra en la sangre periférica, produciendo paludismo, en esta se pueden observar infectando a los hematíes o en el exterior de los mismos.

Material:

-Un capilar heparizado o una pipeta pasteur.

-Dos portaobjetos.

-Un cristalizador y soporte de portas.

-Guantes.

Muestra:

-Sangre capilar o venosa.

Reactivos:

-Metanol.

-Agua destilada.

-Solución de colorante Giemsa al 3% en agua destilada.

Fundamento:

Para el estudio rutinario de muestras sanguíneas susceptibles de contener parásitos palúdicos, se hace una preparación en forma de extensión fina y otra de gota gruesa en el mismo porta.

Cuando se observan extensiones sanguíneas finas para establecer un diagnóstico de palúdismo, debe prestarse atención a los hematíes infectados y a los parásitos que hay dentro de ellos.

En las preparaciones de gota gruesa, los hematíes están lisiados, por lo que el diagnóstico de paludismo se basa en el aspecto de los parásitos que pueden encontrarse.

Procedimiento:

1. Realizar una extensión a mitad del portaobjetos, depositar tres gotas pequeñas en la otra mitad y mezclarlas con movimientos rápidos y circulares.

2.Dejar secar en posición horizontal durante 24 horas.

3. Una vez pasadas las 24 horas, en un cristalizador, depositar tres gotas de metanol en la muestra, dejar reposar durante unos segundos y eliminar el exceso.

4. Depositar la solución de colorante Giemsa al 3% preparada en el laboratorio en una cubeta de coloración  y sumergir la preparación durante 30-45 minutos.

5. Verter agua limpia en otra cubeta y aclararla preparación.

6. Dejar secar la preparación en posición vertical y observar a microscopio.

Interpretación de los resultados:

Bueno, en esta práctica al utilizar sangre de personas sanas, no se ha podido observar un parásito de paludismo.

Práctica 7: Realización de una extensión sanguínea. (PVII)(B1)

Fecha:10-11-14

Realización de una extensión sanguínea.(PVII).

Introducción:

Las extensiones sanguíneas se llevan a cabo deslizando un porta sobre otro en el que se ha depositado previamente una gota de sangre.

Con esto se obtiene una fina capa de sélulas sanguíneas que puede ser adecuadamente observada con el microscopio.

Material:

-Una lanceta.

-Algodón o gasas.

-Un capilar no heparizado o bien una pipeta pasteur.

-Portaobjetos(mínimo dos)

-Guantes.

-Rotulador de vidrio.

Muestra:

-Sangre capilar o venosa.

Fundamento:

En esta práctica lo que se logrará es la facilidad del manejo de los portas para lograr una extensión buena.

Procedimiento:

1.Esta vez a ser la primera vez en realizar extensiones, y para familiarizarnos con estas, lo que haremos será verter una cantidad pequeña de sangre de la bolsa, se ha de sacar la bolsa del frigorífico, moverla muy bien, quitar las pinzas que cortan el paso de la sangre y con cuidado levantar la bolsa mientras se vierte la sangre en un tubo de ensayo, bajar la bolsa, cerrar con la pinza y dejarla en el frigorífico de nuevo.

2.Con un capilar o una pipeta pasteur, depositar un pequeña gota de sangre (5 microlitros) en un extremos del porta.

3.Con otro porta extensor, lo colocamos delante de la gota y lo arrastramos por la superficie hasta esta, unza vez llegado a la gota, dejar que la gota se extienda por el filo del porta extensor.

4. Antes de que la sangre alcance los extremos del filo del porta extensor, deslizar el porta extensor hacia la dirección opuesta a la primera, con un movimiento firme, uniforme y a una velocidad media.

5. Secar la extensión agitandola.

6. Observar a microscopio.

Interpretación de los resultados:

-A la hora de leer los resultados se han de tener en cuenta las características própias de una buena extensión y los defectos que puede tener una extensión incorrecta:

Práctica 6:Tinción supravital con azul de metileno. (PV)(B1)

Fecha:07-11-2014.

Tinción supravital con azul de metileno. (PV).

Introducción:

Al investigar las estructuras celulares podemos utilizar dos formas diferentes de tinción: aquellas que se hacen con el tejido muerto y las que utilizan tejido o células vivas para su observación.

Entre las segundas podemos diferenciar las tinciones vitales, que consisten en la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo y las tinciones supravitales, que emplean el colorante sobre células o tejidos vivos aislados del organismo.

En ambos casos loq ue se pretende es destacar los elementos de la célula viva y seguir los procesos vitales en el interior de la misma.

Los colorantes vitales más utilizados son el rojo neutro, que tiñe fundamentalmente los gránulos citoplasmáticos, el verde jano, que tiñe mitocondrias y otros organulos celulares, y el azul de metileno, que tiñe núcleos y algunas estructuras celulares.

Material:

-Microscopio optico.

-Un portaobjetos y un cubreobjetos.

-Tubos de hemólisis.

-Pipetas pasteur.

-Parafilm.

-Sangre capilar o venosa.

-Lanceta.

-Alcohol.

-Gasas.

Muestra:

-Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada.

Reactivos:

-Azul de metileno preparado.

-Oxalato potásico.

Fundamento:

En esta tinción supravital utilizaremos como colorante el azul de metileno nuevo. Este es de carácter básico y tiñe fundamentalmente los núcleos celulares.

Procedimiento:

1. Preparar colorante: Pesar 0.5g de azul de metileno nuevo y 1,6g de oxalato potásico y mezclarlos en 100ml de agua destilada c.s.p (cantidad suficiente para).

2. En un tubo de hemólisis depositamos dos gotas de sangre y otras dos gotas de colorante.

3.Tapar el tubo de hemólisis con parafilm y dejar reposar durante diez minutos.

4.Con la ayuda de una pipeta pasteur, depositamos una gota de la muestra teñida en un portaobjetos y cubrimos con un cubreobjetos.

5.Observamos la preparación resultante al microscopio óptico con el objetivo de 40x.

Interpretación de los resultados:

- La observación a microscopio debe ser rápida, ya que las células no permanecen vivas mucho tiempo, se puede apreciar los núcleos celulares teñidos, pero mi grupo al no esperarnos el tiempo necesario para la fijacion de colorante a las células, se veía poca cosa.